SHF来源的细胞参与AngII介导的胸主 [复制链接]

胸主动脉是动脉瘤和夹层的常见位置。主动脉区被镶嵌的中、外膜细胞所覆盖，这些细胞胚胎期来自SHF或心脏神经嵴。SHF来源的细胞分布于符合胸主动脉病变空间特异性的区域。本研究的目的是确定SHF来源的细胞是否和如何导致胸主动脉病变。

研究方法

对偶发性胸主动脉病变患者和注入AngII的小鼠进行胸主动脉病理检查。采用质谱辅助蛋白质组学方法对注入AngII的小鼠的无明显病理变化的胸主动脉进行分析，并通过单细胞转录组分析来确定SHF来源细胞的分子特征。研究人员通过SHF来源细胞中Lrp1或Tgfbr2的基因缺失来检测SHF来源细胞对血管完整性的影响。

主要研究内容

1.TAAs患者和AngII注射小鼠的主动脉病变梯度

我们首先进行了组织学分析，以确定人类散发性TAA组织的病理模式。α-平滑肌肌动蛋白免疫染色显示，在人TAA组织中，外基质的α-平滑肌肌动蛋白阳性区域明显低于内基质，Movat五色染色发现外基质中胶原沉积较多。

分别用注入AngII的小鼠跟踪CNC和SHF来源的细胞，证明胸主动脉由CNC和SHF来源的SMC组成，SHF来源的细胞局限于胸主动脉，而CNC来源的细胞延伸至主动脉弓。AngII注射增加了血管内侧面积和外膜面积，并且X-gal阳性区域在血管内侧和外膜的SHF来源细胞中显著增加，而在CNC来源细胞中则没有。因此，人类和小鼠TAAs的主动脉病变具有跨壁梯度。SHF来源的细胞易受AngII诱导使血管内侧细胞和外膜细胞增厚。

图1偶发性TAAs患者和AngII注入小鼠的主动脉病理跨壁梯度

2.AngII改变了与细胞外基质组织相关的主动脉蛋白谱

为了揭示AngII诱导胸主动脉病理的分子机制，我们对注入AngII的小鼠胸主动脉进行了蛋白质组学研究。在注入生理盐水和AngII后的第3天采集胸主动脉组织。与注入盐水的小鼠相比，注入AngII改变了个蛋白质丰度。通过富集分析，我们确定这些差异表达蛋白，除与翻译和核糖体相关，还有与ECM相关。蛋白相互作用分析也显示差异表达蛋白中存在ecm相关分子。在注入AngII的小鼠主动脉中，一些收缩蛋白被AngII下调，而Mmp2上调；在TGFβ信号分子中，AngII上调Ltbp2和Tgfb2。在输注3天的短暂间隔内，AngII改变了细胞外基质组织相关的主动脉蛋白谱。

LRP1是一种在ECM成熟过程中发挥作用的多功能蛋白，在SMC中LRP1缺失导致主动脉病变，包括动脉瘤和动脉弯曲以及ECM降解。因此，我们检测了LRP1及其配体的蛋白丰度。主动脉LRP1蛋白丰度未被AngII注射改变，AngII增加了多种LRP1配体，包括Serpine1。由于这些配体通过LRP1被内化到胞质中降解，表明主动脉LRP1功能受损。综上所述，与ECM相关的主动脉蛋白质组早在注入AngII后的第3天就随着多个LRP1配体的增加而改变。

图2AngII改变小鼠胸主动脉ECM相关蛋白

3.SHF来源细胞中LRP1缺失增强AngII诱导的胸主动脉病变

SHF特异性LRP1缺失不会影响小鼠的生长发育，为促进TAAs，小鼠皮下注射AngII4周。超声和原位成像显示，SHF来源的细胞中LRP1缺失增强了AngII诱导的胸主动脉扩张，SHF特异性的LRP1缺失也加重了AngII诱导的胸主动脉破裂和弹性蛋白碎裂。不同基因型对AngII输注反应的收缩压无差异，表明主动脉病变增强与收缩压无关。这些数据支持SHF来源的细胞在胸主动脉的结构完整性中发挥关键作用。

图3SHF来源细胞中LRP1缺失增强了AngII诱导的TAA形成和小鼠主动脉破裂

4.AngII输注损害了SHF来源的SMC和FB的TGFβ信号通路

AngII输注3天后，采集雄性小鼠的主动脉组织。共收集4~5个主动脉组织，获得足够数量的主动脉细胞。根据mGFP信号对细胞进行筛选后，对mGFP阳性细胞进行scRNAseq。scRNAseq分析显示mGFP细胞群中有多种细胞类型，包括SMC、FB和内皮细胞。SMC由33%的SHF来源的细胞组成，AngII输注后增加到55%。与此同时，FB从66%下降到44%。

我们接下来在scRNAseq数据中检测了ECM相关分子。在AngII输注3天后，在SMC中收缩基因增加，增殖基因在SMC和FB中均下调。LRP1配体在SMC和FB中增加。多种ECM组分在SMC和FB簇中都增加了对AngII输注的反应。TGFβ配体对AngII的反应在不同细胞类型之间是不同的。AngII使SMC中Tgfb1-3升高，而FB中Tgfb2-3降低，在SMC和FB中，AngII显著下调TGFβ受体。

图4小鼠SHF来源的SMC和FB中Tgfbr2mRNA显著降低

在注入AngII的小鼠中，在SHF来源的FB中观察到一个独特的FB4亚簇，为了进一步表征FB4亚簇，通过比较所有FB亚簇中的转录组，确定了Marker基因。与细胞分裂相关的基因，结果表明FB4细胞具有增强的增殖特征。AngII输注后，细胞类型之间的细胞相互作用加速,特别是FB4亚簇与SMC、FB1簇的相互作用更为明显。拟时序分析显示FB4细胞来源于FB1细胞。由于这些相互作用，我们随后比较了FB1和FB4亚簇间与ECM成熟相关的DEGs(图5G)。LRP1配体在FB4中均下调，ECM组成基因在FB4中也较低。AngII输注后，FB4中TGFβ受体进一步下调。这些数据表明AngII破坏了SHF来源细胞中的TGFβ信号通路。

为了研究SHF来源细胞中TGFβ信号通路对血管完整性的影响，我们在小鼠SHF来源细胞中删除TGFBR2。SHF特异性TGFBR2缺失导致胚胎死亡和腹膜后出血。此外，与野生型胎鼠相比，SHF特异性TGFBR2缺失的胎儿的流出道明显扩张。因此，SFH来源细胞中TGFBR2缺失导致产前血管病变。这表明SHF来源的细胞通过TGFBR2对血管发育和维持其完整性的重要性。

图5AngII注入小鼠SHF来源成纤维细胞中Tgfbr2mRNA下降明显的亚簇

5.PAI1是注入AngII的小鼠和人TAA的胸主动脉中表现出跨内侧梯度的关键分子

我们整合了小鼠蛋白质组学和scRNAseq数据。使用SHF-SMC聚类，在蛋白质组学和scRNAseq之间有个重叠基因，在两个数据集中有个分子上调。在SHF-FB中，个基因重叠，个基因增加。LRP1配体在注入AngII的小鼠中始终表现出更丰富的丰度。在蛋白质分析中，PAI1(Serpine1)是AngII增加最显著的分子。Westernblot分析显示注入AngII的小鼠胸主动脉中PAI1显著增加(约26倍)。对照组小鼠主动脉中几乎未检测到PAI1的免疫染色，而注入AngII的小鼠胸主动脉中PAI1的免疫染色强烈。注入AngII的小鼠升主动脉，PAI1通过主动脉壁出现；主动脉PAI1以外中膜和外膜为主，与内侧病变的梯度一致。

为了与临床相关，我们评估了人类主动脉标本中SERPINE1mRNA的丰度和蛋白分布。在人类scRNAseq数据中，SMC和FB簇中评估了26个SERPINE1丰度。UMAP图显示，在SMC和FB群的对照和TAA样本中都存在SERPINE1；与对照组相比，人类TAA样本的SMC和FB中的SERPINE1显著升高。免疫染色显示PAI1在人TAA标本的主动脉中膜和外膜中均有表达。与注入AngII的小鼠主动脉一致的是，在大多数TAA组织中，外部弹性板附近的外中膜可见到大量的PAI1区域。分析表明，PAI1是注入AngII的小鼠和人TAA组织的胸主动脉中表现出跨内侧梯度的关键分子。

图6PAI1是注入AngII的小鼠和人TAA的胸主动脉中表现出跨内侧梯度的关键分子

研究结论

我们的研究通过使用多种TAA小鼠模型，强调了SHF来源的细胞在维持血管完整性方面的功能重要性。这项研究为SHF来源的细胞在胸主动脉病变的发展过程中发挥作用提供了强有力的证据。SHF来源细胞的异质性导致了复杂的主动脉病变形成机制，在研究胸主动脉病变的发病机制时应考虑到这一点。

参考文献

HisashiSawada,YurikoKatsumata,HideyukiHigashi.etal.SecondHeartField-derivedCellsContributetoAngiotensinII-mediatedAscendingAortopathies.Circulation..